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CRISPR-Cas9: o poder da edição genética!



         Anunciado ontem na Nature (Ref.1), os chineses serão pioneiros no mundo em tratar pacientes com câncer de pulmão através de células imunológicas modificadas pela famosa técnica CRISPR-Cas9. O time responsável pelo procedimento será liderado pelo Dr. Lu You, um oncologista na Universidade Sichuan, no Hospital do Oeste da China, em Chengdu. Os testes começarão em agosto deste ano, e já tiveram a aprovação ética do hospital no dia 6 de julho. Receberão o tratamento os pacientes que estiverem sem outras opções e onde a quimioterapia não responde. Os EUA pretendem seguir os mesmos passos no final do ano, com algumas modificações de procedimento em relação ao método chinês. As expectativas são grandes de que um grande avanço seja feito na luta contra o câncer. Aproveitando essa excelente notícia, é interessante questionarmos: o que é o tão falado CRISPR-Cas9?

         CRISPR, na sigla em inglês, significa Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (Repetições Curtas Palindrômicas de Grupos  Regulares Interespaçados, na tradução literal). O Cas9 no nome serve para discriminar proteínas ( ´9´) associadas ( ´as´) ao CRISPR. Em geral, o CRISPR-Cas é um recurso evolutivo utilizado pelas bactérias para alvejar e inutilizar o DNA de organismos bacteriófagos (que atacam/comem bactérias), como certos tipos de vírus, e impedir que os mesmos cumpram suas funções normais. Em outras palavras, é uma espécie de sistema imunológico desses seres procariontes. O CRISPR-Cas9 é específico do Streptococcus pyogenes e alguns outros tipos de bactérias. Por causa das peculiaridades do processo, o CRISPR-Cas9 tornou-se uma grande ferramenta na mão dos cientistas, sendo, atualmente, o agente preferido para se editar genes.
Estrutura cristalina do CRISP-Cas9, resolvida em 2014; cada região colorida possui um papel específico na enzima
           Colocando de uma forma objetiva, o CRISPR-Cas9 é uma enzima endonuclease guiada por um fragmento de RNA. A partir de um complexo mecanismo bioquímico de ação, essa enzima se liga a uma parte do DNA alvo, guiada pelo fragmento de RNA, e, como uma tesoura, corta uma sequência do mesmo em um ponto específico. Normalmente, o maquinário reparador do DNA consegue remendar o corte, mas frequentemente comete erros durante o conserto, e é nisso que as bactérias apostam, para que o vírus predador, por exemplo, não atue como deveria. Aproveitando-se disso, os cientistas pegaram esse sistema para estudar sequências genéticas específicas nas mais variadas células. Modificando o CRISPR-Cas9 eles podem programar diferentes fragmentos de RNA para se anexarem em pontos específicos do DNA alvo, sem o cortarem, e impedir a expressão de um gene X (1). A enzima modificada é chamada, nesse exemplo, de ´CRISPR-Cas9 morto´, e criaria uma espécie de bloqueio, onde o RNA polimerase, por exemplo, não conseguiria alcançar o gene bloqueado e produzir uma proteína prevista pelo código genético. Criando ativadores, os cientistas podem pegar esse CRISPR-Cas9 morto e fazê-los expressarem o gene bloqueado, mesmo se esse gene não tiver sido programado para ficar ativo no DNA (2). Com isso, é possível criar verdadeiros interruptores genéticos, fazendo com que os genes de interesse sejam ligados e desligados ao bel prazer dos cientistas. Além disso, com a ajuda de guia do CRISPR-Cas9, modificações podem ser implantadas em um local específico do DNA e até genes de interesse podem ser anexados caso seja usado o poder de corte do sistema enzimático (corta-se um ponto do DNA para a inserção de um gene Y no lugar).  Resumindo, essa ferramenta pega emprestada das bactérias permite uma fantástica manipulação de genes de forma muito precisa.

Parte de uma esquema elaborado pela Nature (Ref.7), mostrando a ação do CRISPR-Cas9 e duas das suas aplicações (adicionei algumas legendas nos pontos chaves das ilustrações)
          Em uma exemplificação prática, pesquisadores no laboratório norte-americano do CCR (Centro para Pesquisas do Câncer, na tradução da sigla em inglês), ano passado, programaram o CRISPR-Cas9 para desativarem 9 mil potenciais genes ligados ao crescimento de tumores em ratos e humanos (Ref.2). Esses genes, listados em uma biblioteca genética, eram desativados para os pesquisadores observarem os efeitos consequentes provocados no crescimento do tumor. Ou seja, cada população de células tumorais, em milhares, tinha um gene específico em seu DNA desativado. As populações de células que se desenvolviam com dificuldade mostravam que um gene X, entre os 9 mil sendo testados, era importante para o crescimento. Se esse gene X não for necessário para células saudáveis crescerem, ele se torna um ótimo alvo para medicamentos que visem desativá-lo de vez no corpo de um paciente com câncer. Em outro exemplo, em abril do ano passado um grupo de pesquisadores chineses usou o CRISPR-Cas9 para editar o genoma de embriões humanos (Ref.3). Eles usaram o processo para modificar o gene responsável pela beta-thalassaemia - uma desordem sanguínea potencialmente fatal - e ver se o embrião modificado passaria a não mais ter o gene problemático durante as divisões celulares. Isso gerou bastante polêmica por mexer na ética envolvida com a manipulação genética da vida humana. De qualquer forma, os testes mostraram que a técnica, apesar de eficiente, possui ainda muitas limitações, onde vários embriões testados não responderam como o esperado, sendo que apenas em uma parcela mínima o gene foi suprimido com sucesso.

           No tratamento pioneiro liderado pelo time do Dr. Lu, será extraído células do sistema imunológico dos pacientes com câncer de pulmão chamadas de T células (aquelas que o vírus do HIV invade), e, então, entrará o CRISPR-Cas9 para desativar um gene no DNA das mesmas responsável pela produção da proteína PD-1. Essa proteína é associada com a resposta imunológica das T células e impede que essas ataquem as células saudáveis do corpo, minimizando problemas como as doenças autoimunes (3). Vários tipos de células tumorais expressam em grande quantidade o ligante PD-L1, este o qual é responsável por se ligar com o PD-1 e sinalizar às células de defesa para não atacarem. Por isso o sistema imunológico encontra grande dificuldade em combater esses cânceres. Existem medicamentos no mercado que são usados para bloquear a ação do PD-1, com relativo sucesso, mas não o suficiente para ser eficaz em grande parte dos casos. E é nesse ponto que o CRISPR-Cas9 torna-se útil, já que desativará de vez a expressão do PD-1 das células T, fazendo com que elas consigam atacar o câncer com maior facilidade. O time de pesquisa irá modificar essas células de defesa, multiplicá-las em laboratório, e injetar no corpo dos pacientes, esperando que as mesmas corram para o ataque no tumor. Existem riscos, porém, de que essas células possam atacar outras células saudáveis no corpo, em grande quantidade e, por isso, cautela será usada no tratamento.

             Nesse ponto, é bom deixar bem claro que o CRISPR-Cas9 não é a única ferramenta de edição genética e, de longe, também não é a melhor. Técnicas como a ´Zinc-finger Nucleases´ e a ´Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)´ são muito mais eficientes e produzem bem menos erros de edição genética. A fama e popularidade do CRISPR-Cas9 reside no seu baixo custo, rapidez e facilidade de operação em relação às outras técnicas. Qualquer laboratório com um porte mínimo consegue usar o processo com tranquilidade e boa eficácia, permitindo a realização de vários trabalhos em um curto espaço de tempo e a custos acessíveis. E isso é perfeito para os avanços genéticos, já que muito mais pesquisadores no mundo passam a conseguir trabalhar bem seus projetos genéticos, algo que permite um gigantesco acúmulo positivo de conhecimento na área. Contudo, é preciso ficar de olho também nas deficiências do CRISPR-Cas9, sendo necessário checar sempre os resultados de pesquisa com muito cuidado. Nos planos de desativação do PD-1, por exemplo, os pesquisadores terão que conferir bem se o gene visado foi realmente desativado e não outra parte do código genético dentro das células T, algo que poderia ser desastroso.

          Analisando essa última observação, é fácil entender também o porquê de existir uma certa polêmica em cima do uso do CRISPR-Cas9. Já que é um método fácil de ser usado e barato, fica difícil controlar quem está usando a ferramenta ao redor do mundo. Pesquisas genéticas ilegais podem estar sendo feitas e a ética científica quebrada em vários cantos. Editar genes é perigoso se feito de qualquer jeito, porque isso pode criar mutações e produtos biológicos diversos e perigosos para o meio ambiente, caso o material genético modificado vaze dos laboratórios. Dentro da China, por exemplo, onde as pesquisas do tipo são amplamente liberadas, possuindo pouquíssimas restrições, isso se torna extremamente preocupante. Mas não podemos parar os avanços científicos por causa disso e uma melhor fiscalização é o melhor caminho de contorno para resolver a situação.

(1) Um gene é a região do DNA que coordena uma função específica e é unidade molecular da hereditariedade. Ou seja, longas sequências de nucleotídeos, com suas bases nitrogenadas correspondentes (adenina, guanina, citosina e timina, no caso do DNA), correspondem a um gene, o qual pode coordenar a produção de uma proteína específica através de um RNA transcrito. Dentro dos cromossomos, os quais são formados por longas cadeias de DNA, encontramos milhares de genes, os quais formam genoma. Devido à existência de vírus que usam o RNA como código genético, atualmente considera-se que os genes também englobam regiões do RNA em certas situações de exceção.

(2) É sabido que cerca de 2% apenas dos genes expressos no código genético de uma pessoa, por exemplo, estão realmente ativos, com o resto não possuindo função clara no organismo. Porém, pesquisas mais recentes sugerem que grande parte deles possuem, sim, um importante papel. Além disso, certos genes no corpo só são expressos depois de um estímulo ambiental, ficando inativos desde o nascimento do ser, ou seja, os famosos fatores epigenéticos. O CRISPR-Cas9 pode ser uma grande ajuda para desvendar esses genes mais "tímidos".

(3) Doenças autoimunes são aquelas onde o próprio sistema imunológico da pessoa ataca seu corpo. A diabetes tipo 1 é um exemplo bem conhecido, onde as células de defesa do organismo atacam as áreas do pâncreas responsáveis pela produção de insulina.

OBS.: Outros CRISPR-Cas de bactérias diversas estão também sendo analisados para a confecção de outras potenciais ferramentas de edição genética.

ATUALIZAÇÃO (16/11/16): E, pela primeira vez, células com seu material genético editado pelo CRISPR-Cas9 foram injetadas em um paciente por um grupo chinês, para o tratamento de um caso avançado de câncer de pulmão.

Os pesquisadores envolvidos cortaram o gene responsável pela produção da proteína PD-1 em células de defesa retiradas do paciente. Essa proteína age como um freio para as respostas imunológicas, algo aproveitado pelas células cancerígenas para driblar as defesas do organismo, como já foi discutido no texto acima. Logo em seguida, os pesquisadores multiplicaram elas e injetaram o montante de células modificadas de volta no paciente, com a esperança que agora elas ataquem agressivamente o tumor.

O teste, e outros sendo planejados de forma paralela, está sendo executado de forma cautelosa, com o máximo de segurança possível. Caso o tratamento dê certo, será um marco gigantesco na busca por uma cura do câncer (apesar que se isso funcionar em um certo tipo de tumor, pode não funcionar para outros tipos). (Ref.11)


REFERÊNCIAS CIENTÍFICAS
  1. http://www.nature.com/news/chinese-scientists-to-pioneer-first-human-crispr-trial-1.20302
  2. http://www.cancer.gov/about-cancer/causes-prevention/research/crispr
  3. http://www.nature.com/news/chinese-scientists-genetically-modify-human-embryos-1.17378 
  4. http://www.nature.com/news/crispr-the-disruptor-1.17673
  5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27120160
  6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25827103
  7. http://www.nature.com/news/crispr-gene-editing-is-just-the-beginning-1.19510
  8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25408407
  9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26562159?dopt=Abstract
  10. http://www.seminoncol.org/article/S0093-7754(10)00159-4/abstract 
  11. http://www.nature.com/news/crispr-gene-editing-tested-in-a-person-for-the-first-time-1.20988